在日本理研脑科学研究所，我们正在研究高度调节的哺乳动物中枢神经系统是如何建立的，以及它是如何受到环境和遗传因素的影响。作为这项研究的一部分，我们使用标准的遗传学程序培养基因突变小鼠，并研究这些小鼠的行为表型。利用这些实验数据，我们通过分析大脑区域对外部刺激(如气味、声音和光线)的反应，将特定的基因与行为联系起来。目标之一是更好地理解注意力和冲动的分子和细胞机制，并推进相关行为障碍的治疗。
为了量化大脑特定区域的活动，我们使用脑切片成像和标准酶抗体染色来检测c-Fos的表达水平，c-Fos被认为是神经活动的指标。这种染料使活性细胞变暗，使它们能够在大脑的显微图像中被识别和计数(图1)。
在分析图像时，我们在神经科学和生物学实验室中经常出现挑战：检测和计算数千个图像中的数百个斑点。我们的团队与Mathworks顾问合作开发Matlab®该应用程序自动检测相关点和流线的过程，用于管理实验室中的图像数据。该应用程序将分析单个图像所需的时间减少了100倍，增加了实验室可以分析的样品数量，识别了人工检查中遗漏的点，并简化了数据管理。
分析图像手动
由于实验室处理的典型图像包含300到400个点之间，因此Riken研究人员通常花费15分钟或更长时间分析每个图像。对于每个测试对象，必须分析大约100张图像，因此需要数天才能从一只鼠标处理图像。这项工作是单调的，结果易受偏见和主体性的影响。例如，我们发现当图像有很多斑点时，研究人员倾向于计算在具有较少斑点的图像中忽略的某些暗区。
除了处理单个图像所需的努力外，我们的团队还花了大量时间管理和跟踪我们处理的所有图像的数据。有时，文件会暂时放错地方，而且很难跟踪需要进一步分析的图像。
为了解决这些挑战，RIKEN联系了MathWorks顾问，他建议使用MATLAB和图像处理工具箱™开发应用程序，以自动检测和计数斑点，并帮助我们简化数据管理工作流程以进行实验结果。
开发识别阈值的算法
在图像中识别斑点的关键步骤是为像素亮度找到一个阈值，超过该阈值的任何黑暗区域都被视为斑点。一旦该阈值确定，就用它将原始灰度图像转换为二进制版本，其中每个点都是完全白色的，背景是完全黑色的，分别用1和0表示。然而，这个阈值因图像而异。更重要的是，识别阈值的最有效技术也可能因图像而异。
MathWorks咨询团队实现了四种不同的算法来查找阈值。第一个使用塔布林在图像处理工具箱中的功能应用OTSU的方法，该方法标识了最小化黑白像素的跨界方差的阈值。第二算法基于全局像素密度选择阈值，使得阈值的每一侧的像素百分比是全局强度方差的函数。第三个使用与第二种相同的方法，但基于本地强度方差而不是全局。第四个使用与第三种相同的方法，但是将额外的步骤应用于分离连接的点，在许多点彼此接触的图像中提供更准确的计数。
图像预处理和后处理
除了开发用于设置阈值的算法之外，MathWorks顾问还实现了预处理和后处理步骤，以提高整个过程的有效性。
预处理步骤包括通过调整对比度和强度来降低光晕效应，通过低通滤波器来降低噪声，并用形态运算平滑斑点边缘。用于二值图像的后处理步骤包括中值滤波和形态学操作，以区分斑点和噪声和不相关的边缘。
后处理后,BLOB分析在图像上执行以计算暗点的数量，并消除任何剩余的大暗区或背景噪声。
顾问测试了数百幅图像的预处理、阈值、后处理和blob分析操作，以改进算法和微调参数。
构建图形界面
为了使Riken研究人员更容易使用图像处理算法，咨询团队开发了基于MATLAB的界面（图2）。
加载要处理的图像后，我们使用该接口标记图像内的感兴趣区域（ROI）（图3）。
然后选择所需的阈值算法并调用图像处理算法。算法识别出的点被计算出来，并在屏幕上显示出来供审查。我们有时会立即使用不同的阈值方法对图像进行重新处理，然后再使用最有效的方法对特定图像产生的结果。
作为最后一步，我们指定了MATLAB或Microsoft®保存结果的Excel文件，包括点的个数、主题号、日期、阈值方法和使用的ROI。
加速研究
使用新的MATLAB图像处理应用程序，我们可以分析图像以秒为单位 - 明显更少时间比以前所需的15分钟更少。过去，我们的团队很少对大脑的整个区域进行神经影像分析（约100个图像），因为它需要这么多时间和精力。该分析现在在Matlab中完成此分析而不是花几天。同样重要的是，我们获得了更好的结果，因为检测算法识别肉眼无法检测到的斑点。
随着自动Matlab系统到位，我们在繁琐的计数任务上花费较少的时间，释放我们更多地关注我们对重要研究活动的关注和专业知识。这个额外的时间，再加上处理更多图像的能力，使Riken探讨了几个未考虑的新研究路径，并有助于我们集团的研究进展。例如，我们现在可以筛选整个大脑区域以找到给定刺激的投资回报率，比较不同的转基因受试者组。
我们计划在类似的研究举措中实施与MATLAB的图像处理自动化，包括钙指示剂用于突出活细胞在染色体图像中的某些刺激的响应和另一个涉及的刺激在活的有机体内信号分析。
